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PCR儀常見問題及回答
2012-06-19
1. cDNA產(chǎn)量的很低
可能的原因：
*RNA模板質(zhì)量低
*對mRNA濃度估計(jì)過高
*反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足
*同位素磷32過期
*反應(yīng)體積過大，不應(yīng)超過50μl
2. 擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳分析時(shí)沒有條帶或條帶很淺
*最常見的原因在于您的反應(yīng)體系是PCR的反應(yīng)體系而不是RT-PCR的反應(yīng)體系
*與反應(yīng)起始時(shí)RNA的總量及純度有關(guān)
*建議在試驗(yàn)中加入對照RNA
*第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在總的反應(yīng)體系中的含量不要超過1/10
*建議用Oligo(dT)或隨機(jī)引物代替基因特異性引物(GSP)用于第一鏈合成。由于RNA模板存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀結(jié)果，有可能導(dǎo)致GSP無法與模板退火;或SSⅡ反轉(zhuǎn)錄酶無法從此引物進(jìn)行有效延伸。
*目的mRNA中含有強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)，可以試用以下方法解決：
a. 將第一鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃。
b. 使用隨機(jī)六聚體代替Oligo(dT)進(jìn)行第一鏈反應(yīng)。
3. 產(chǎn)生非特異性條帶
*用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。
*在PCR反應(yīng)中，非特異的起始擴(kuò)增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。
*由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。
4. 產(chǎn)生彌散(smear)條帶
*在PCR反應(yīng)體系中第一鏈產(chǎn)物的含量過高
*減少引物的用量
*優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)
*在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時(shí)，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，一般會(huì)顯示為彌散背景。
5. 產(chǎn)生大分子量的彌散條帶
*大多數(shù)情況下是由于退火溫度過低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的
*對于長片段的PCR，建議將反應(yīng)體系中cDNA的濃度稀釋至1:10(或1:100-1:200)
6. 在無反轉(zhuǎn)錄酶的情況下，對照RNA獲得擴(kuò)增結(jié)果
*通常是由于對照RNA中含有痕量DNA而導(dǎo)致的。由于進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄時(shí)不可能將所有的DNA模板消除。建議可將第一鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。
*有可能是引物二聚體的條帶
7. 擴(kuò)增產(chǎn)物滯留在加樣孔中
*有可能是由于模板量過高而導(dǎo)致PCR結(jié)果產(chǎn)生了高分子量的DNA膠狀物。建議將第一鏈結(jié)果至少稀釋100倍再進(jìn)行二次擴(kuò)增。
*另外，在二次PCR時(shí)使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可以將退火溫度適當(dāng)增高或進(jìn)行熱啟動(dòng)以提高特異性。
8. SSⅢ與SSⅡ有何不同?
*具有更高的熱穩(wěn)定性(達(dá)50℃)
*具有更長的半衰期(達(dá)220分鐘)
*對PCR無抑制
*干冰運(yùn)輸
*Tdt活性更低
9. 為什么有人更喜歡用SSⅢ而不是ThermoScript?
ThermoScript如果保存不當(dāng)會(huì)引起活性很快降低，SSⅢ則更穩(wěn)定。
10. 為什么使用基因特異性引物(GSP)?
GSP在擴(kuò)增低豐度的轉(zhuǎn)錄本時(shí)是最好的。OligodT引物建議用于高質(zhì)量RNA及全長轉(zhuǎn)錄本的逆轉(zhuǎn)錄;隨機(jī)引物用于mRNA片段的逆轉(zhuǎn)錄。
11. 什么情況下需要使用RNase H?
在第一輪PCR中RNA/DNA雜合體不能正常變性時(shí)
12. 根據(jù)不同的目的選擇不同的系統(tǒng)：
目的 建議
RT與PCR使用不同的引物
或需要靈活選擇PCR DNA聚合酶 兩步法RT-PCR系統(tǒng)
高靈敏度 一步法或兩步法RT-PCR系統(tǒng)
高特異性 含有適當(dāng)?shù)腄NA聚合酶的兩步法RT-PCR系統(tǒng)
或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系統(tǒng)
高保真度 含有Pfx Taq酶的兩步法RT-PCR系統(tǒng)
長的反轉(zhuǎn)錄結(jié)果 通常使用兩步法RT-PCR系統(tǒng)可達(dá)到最佳結(jié)果
含Elongase酶的一步法RT-PCR系統(tǒng)
二、Generacer
1. 如何針對Generacer試劑盒設(shè)計(jì)基因特異性引物(GSP)?
使用5’或3’RACE試劑都需要至少一條基因特異性引物，您在設(shè)計(jì)引物時(shí)需要注意以下幾點(diǎn)要求：
*50-70%的GC含量，以提高引物熔點(diǎn)(Tm)
*23-28個(gè)堿基長度，以提高引物特異性
*降低3’端GC含量，將引物非特異性結(jié)合的可能性降至最低
2. 為什么得不到RACE產(chǎn)物?
*加入Hela對照
*低質(zhì)量的RNA模板
*逆轉(zhuǎn)錄失敗，SSII和SSIII非常適用于長模板cDNA的合成
*目的基因豐度太低，可以通過提高PCR的循環(huán)次數(shù)來解決，建議使用巢式PCR
*目的基因沒有表達(dá)，可以通過使用兩條GSPs來分析cDNA中是否含有目的基因
*目的基因太長而不適合進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，建議使用GeneRacer試劑盒中的Oligo dT來得到全長cDNA，使用隨機(jī)引物或與模板的5’端盡可能近的GSP進(jìn)行PCR。
*cDNA模板屬于困難模板，可以通過以下方法解決：優(yōu)化PCR反應(yīng)參數(shù)及反應(yīng)體系;降低退火溫度;使用5-10%的DMSO幫助通過高GC含量區(qū);使用高保真度和高延伸能力的酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。
3. RACE的PCR結(jié)果有雜帶
RACE PCR雜帶或非特異性PCR條帶可能是由于以下原因：
*GSP與其他cDNA的非特異性結(jié)合會(huì)導(dǎo)致在擴(kuò)增目的產(chǎn)物時(shí)得到無關(guān)產(chǎn)物。
*GeneRacer引物和cDNA的非特異性結(jié)合會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生一端帶有GeneRacer引物序列的PCR產(chǎn)物。
*RNA降解。
*PCR管或試劑污染。
注意：雜帶一般是因?yàn)闆]有優(yōu)化PCR條件，可以加入陰性對照來確定。
4. 得不到全長的5’RACE PCR產(chǎn)物
*CIP反應(yīng)后的RNA降解產(chǎn)生了新的帶有5’磷酸的斷裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo連接。一定要小心操作，保證RNA無降解。
*CIP脫磷酸不完全，可以增加反應(yīng)中CIP的量或減少RNA的量。
*PCR產(chǎn)生了雜帶，并不是真正的連接產(chǎn)物，可以使用上述建議優(yōu)化PCR。
二、Generacer
1. 如何針對Generacer試劑盒設(shè)計(jì)基因特異性引物(GSP)?
使用5’或3’RACE試劑都需要至少一條基因特異性引物，您在設(shè)計(jì)引物時(shí)需要注意以下幾點(diǎn)要求：
*50-70%的GC含量，以提高引物熔點(diǎn)(Tm)
*23-28個(gè)堿基長度，以提高引物特異性
*降低3’端GC含量，將引物非特異性結(jié)合的可能性降至最低
2. 為什么得不到RACE產(chǎn)物?
*加入Hela對照
*低質(zhì)量的RNA模板
*逆轉(zhuǎn)錄失敗，SSII和SSIII非常適用于長模板cDNA的合成
*目的基因豐度太低，可以通過提高PCR的循環(huán)次數(shù)來解決，建議使用巢式PCR
*目的基因沒有表達(dá)，可以通過使用兩條GSPs來分析cDNA中是否含有目的基因
*目的基因太長而不適合進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，建議使用GeneRacer試劑盒中的Oligo dT來得到全長cDNA，使用隨機(jī)引物或與模板的5’端盡可能近的GSP進(jìn)行PCR。
*cDNA模板屬于困難模板，可以通過以下方法解決：優(yōu)化PCR反應(yīng)參數(shù)及反應(yīng)體系;降低退火溫度;使用5-10%的DMSO幫助通過高GC含量區(qū);使用高保真度和高延伸能力的酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。
3. RACE的PCR結(jié)果有雜帶
RACE PCR雜帶或非特異性PCR條帶可能是由于以下原因：
*GSP與其他cDNA的非特異性結(jié)合會(huì)導(dǎo)致在擴(kuò)增目的產(chǎn)物時(shí)得到無關(guān)產(chǎn)物。
*GeneRacer引物和cDNA的非特異性結(jié)合會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生一端帶有GeneRacer引物序列的PCR產(chǎn)物。
*RNA降解。
*PCR管或試劑污染。
注意：雜帶一般是因?yàn)闆]有優(yōu)化PCR條件，可以加入陰性對照來確定。
4. 得不到全長的5’RACE PCR產(chǎn)物
*CIP反應(yīng)后的RNA降解產(chǎn)生了新的帶有5’磷酸的斷裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo連接。一定要小心操作，保證RNA無降解。
*CIP脫磷酸不完全，可以增加反應(yīng)中CIP的量或減少RNA的量。
*PCR產(chǎn)生了雜帶，并不是真正的連接產(chǎn)物，可以使用上述建議優(yōu)化PCR。
三、PCR
在進(jìn)行PCR時(shí)：
*請確保您沒有使用過量的起始DNA或者過高濃度的引物，也沒有加入過量的Mg++
*請確保您使用了恰當(dāng)?shù)耐嘶饻囟?/p>
*請確保您沒有使用過量的DNA聚合酶
四、引物
1. 應(yīng)該選擇哪種純化方法?
取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵锏拈L度
2. 為什么我訂購了50nmol，但是收到卻只有40nmol?
50nmol是起始量
3. 怎樣制備100μM的儲(chǔ)液?
體積(μl)=質(zhì)檢報(bào)告上的nmol數(shù)目×10
4. 怎樣設(shè)計(jì)引物?
*一般長度20-30bp;
*至少50%的GC含量;
*避免引物二聚體和二級(jí)結(jié)構(gòu);
*引物對的Tm值應(yīng)該接近。
5. 引物序列有插入或缺失?
*使用上游和下游引物多測幾個(gè)克隆。
*請選擇正確的純化方法。
6. PCR無結(jié)果?
*請檢查引物設(shè)計(jì)是否正確;
*請檢測OD讀數(shù)是否正確;
*做一個(gè)陽性對照和一個(gè)陰性對照
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