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PCR儀操作步驟
2012-06-19
PCR的反應(yīng)包括三個主要步驟：分別是1. Denaturation 2. Annealing of primers,3. Extension of primers。 所謂 Denaturing乃是將DNA加熱變性， 將雙股的DNA加熱后轉(zhuǎn)為單股DNA以做為復(fù)制的模板. 而Annealing 則是令 Primers于一定的溫度下附著于模板DNA兩端。 最后在DNA聚合酶 e.g. Taq-polymerase 的作用下進行引物的延長 Extension of primers及另一股的合成。
PCR技術(shù)神奇就神奇在以下幾個特點上：一是被擴增的DNA所需量極小，理論上講一個分子就可以用于擴增了;二是擴增效率高，幾個小時就擴增1000萬倍以上?，F(xiàn)在PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)研究、食品衛(wèi)生、醫(yī)療、法醫(yī)及環(huán)境監(jiān)測等諸多方面，真不愧是“獲得諾貝爾獎”的好技術(shù)!
PCR的最早設(shè)想 核酸研究已有100多年的歷史，本世紀(jì)60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korana于1971年最早提出核酸體外擴增的設(shè)想：“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。
PCR的實現(xiàn)
1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時間。
PCR的改進與完善
Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片
段，其缺點是：
?、貹lenow酶不耐高溫， 90℃會變性失活，每次循環(huán)都要重新加。
?、谝镦溠?/p>
伸反應(yīng)在37℃下進行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的
DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴增具備許多突出的優(yōu)點，
但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成
一個擴增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時間內(nèi)沒能引
起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。
1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較
高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。
1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌thermus aquaticus 中提取到一種
耐熱DNA聚合酶。 此酶具有以下特點：①耐高溫，在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的
90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40
%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴增片段特異
性和擴增效率，增加了擴增長度2.0Kb。由于提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也
大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區(qū)別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶Taq DNA
Polymerase。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。
獲得諾貝爾獎的PCR技術(shù)
1995年，美國科學(xué)家Mulis眾望所歸地獲得了諾貝爾化學(xué)獎，他所取得的成就是發(fā)明了PCR技術(shù)。
PCR，中文譯為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其實是一種DNA的快速擴增技術(shù)，其擴增效率之高就象核裂變的“鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”那樣。PCR技術(shù)通過兩個短的稱為引物的DNA小片段和一種耐熱的酶的作用，可以在3個小時內(nèi)把特定的DNA量提高1000萬倍。這種技術(shù)一問世，立刻引起了分子生物學(xué)研究的一場革命，人們利用這種轟動全世界的技術(shù)很快就把微觀領(lǐng)域的生物學(xué)研究大大地往前推了一步?？梢赃@么說，PCR技術(shù)使分子生物學(xué)研究一下子獲得了突破，而且隨著PCR技術(shù)的日趨完善，PCR在人類社會生活中的應(yīng)用也越來越廣泛。比如說在“DNA指紋”中我們提到，科學(xué)家們只需要一根頭發(fā)甚至一個細胞就可以完成DNA指紋的鑒定工作，這里實際上就要采用PCR技術(shù)，因為一個細胞中的DNA含量實在太少了，人們根本不可能檢測到它的指紋;有了PCR技術(shù)就好辦了，通過PCR技術(shù)把這個細胞中的DNA片斷擴增1000萬倍，這樣DNA量就足夠作指紋鑒定了。再比如，在醫(yī)院里檢驗血液中的某種病毒，有時病毒量極少(例如有的艾滋病病毒攜帶者)，通過傳統(tǒng)的檢查方法費力又費時，這時PCR技術(shù)也許就可以幫上忙。可以先選定這種病毒DNA上的一段DNA，設(shè)計合適的引物DNA，然后通過PCR技術(shù)一擴增很快就可以判斷出血樣中是否擴增出了大量的DNA，如果是的話，那么就說明血樣中帶有該種病毒了。PCR方法不但有極高的靈敏度，而且可以同時一次做近百個擴增反應(yīng)，省時省力效率高。
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