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PCR儀基因擴(kuò)增儀的選擇技巧
2012-06-19
PCR儀基因擴(kuò)增儀的選擇技巧
PCR原理
DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶的作用下，以單鏈為模版，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成新的單鏈，與模版配對成為雙鏈分子挎貝。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計與模板DNA的5’端結(jié)合的兩條引物，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制，多次重復(fù)“變性解鏈—退火—合成延伸”的循環(huán)就可以以幾何級數(shù)大量擴(kuò)增特定的基因。
發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該類酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。
從PCR原理可以看出，PCR儀的關(guān)鍵是升降溫的步驟?，F(xiàn)在偶爾還能聽到一些前輩們笑談早年的PCR實(shí)驗(yàn)如何在3個中完成的趣聞。經(jīng)過不斷改進(jìn)，今天的PCR已經(jīng)越來越完善和智能化。出于市場推廣的戰(zhàn)略需要，各廠家的PCR儀型號不同，著力宣傳的技術(shù)指標(biāo)和參數(shù)也不盡統(tǒng)一，生物通的編者在這里簡單列出選購時我們認(rèn)為應(yīng)該考慮的常用指標(biāo)，希望有助于大家選購PCR儀的選購技巧。
PCR儀介紹及其選購
PCR儀的種類總體來說可以分為兩大類：PCR擴(kuò)增儀和實(shí)時熒光定量PCR儀，普通的PCR擴(kuò)增儀又衍生出帶梯度PCR功能的梯度PCR儀、和帶原位擴(kuò)增功能的原位PCR儀等等。1996年由ABI公司首先推出將擴(kuò)增和檢測融為一體的實(shí)時熒光定量PCR儀，
一、溫度控制
對普通PCR儀來說，溫度控制指標(biāo)主要是指溫度的準(zhǔn)確性、均勻性、以及升降溫速度，對梯度PCR儀來說，除了溫度的準(zhǔn)確性和均勻性、升降溫速度以外，還必須考慮儀器在梯度模式和標(biāo)準(zhǔn)模式下是否具有同樣的溫度特性。
溫度的準(zhǔn)確性是指樣品孔溫度與設(shè)定溫度的一致性，它直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。如果排除樣品加入過程中的問題，對于PCR反應(yīng)而言最重要的莫過于溫度控制的準(zhǔn)確性，由于PCR是一個幾何級數(shù)擴(kuò)增的過程，擴(kuò)增過程中退火溫度的細(xì)微變化會被放大而直接影響結(jié)果，不論是變性、退火還是延伸都需要準(zhǔn)確控制溫度，對退火溫度而言溫控顯的尤為重要，有時1度甚至0.5度的差異也能決定實(shí)驗(yàn)的成功與失敗，所謂差之毫厘，謬之千里。因而對PCR擴(kuò)增儀而言溫度控制就意味著質(zhì)量。
溫度的均勻性是指樣品孔間的溫度差異，它關(guān)系到在不同樣品孔進(jìn)行反應(yīng)結(jié)果的一致性。我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有時用同樣的樣品，同樣的PCR反應(yīng)程序，最后的結(jié)果竟然差異非常明顯，或許就是因?yàn)椴煌恢玫臏囟炔痪恍运?。一些使用過早期PCR儀的腦子格外靈光的研究人員偏愛使用PCR儀中間某幾個固定的孔，就是因?yàn)檫^往反復(fù)的教訓(xùn)和認(rèn)真的思索得出了這樣的結(jié)論，PCR儀的溫度均勻性不好，特別是最外周的樣品孔情況更差，很有可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果——即“位置的邊緣效應(yīng)”會影響結(jié)果的可重復(fù)性。正是這種位置效應(yīng)對定量PCR的結(jié)果的影響更為明顯，所以后來才有Roche和Cobbett的離心式定量PCR的重大創(chuàng)新。
溫度控制除了精確度，還有一個廠家喜歡大力宣傳的指標(biāo)——升降溫的速度。更快的升降溫速度，可以縮短反應(yīng)進(jìn)行的時間，而且縮短了可能的非特異性結(jié)合、反應(yīng)的時間，能提高PCR反應(yīng)煌特異性。因此從本質(zhì)而言溫控方式就從以前相對穩(wěn)定耐用的機(jī)械式轉(zhuǎn)向了升降溫更快速的半導(dǎo)體。除了機(jī)械本身的原因，影響升降溫速度的還有制作承托樣品管的基座模塊的材料的導(dǎo)熱性。
作為用戶來說，當(dāng)然更愿意選擇升降溫速度快的，這就像汽車上好看的表面配置一樣容易看到，而內(nèi)在的穩(wěn)定性和耐用性往往是看不到的而容易被忽略。必須注意到，儀器的升降溫速度和樣品管中的樣品的升降溫速度并非同一回事，因?yàn)闃悠饭芘c基座接觸的緊密性、導(dǎo)熱性、鄰近樣品管的相互影響都會影響樣品的實(shí)際升降溫速度。
現(xiàn)在的PCR儀一般具有兩種溫控模式，即模塊溫控模式(Block-control)和反應(yīng)管溫控模式)(tube-control)。在模塊溫控模式下，機(jī)器根據(jù)探se器直接探se的溫控模塊(即承載樣品的金屬臺)的溫度進(jìn)行控制，這種模式適用于長時間的靜態(tài)孵育(如連接、酶切、去磷酸化等)。反應(yīng)管溫控模式實(shí)際上是一種模擬試管/PCR板的溫控模式，根據(jù)探se器所探測到的溫控模塊的溫度由計算機(jī)計算出管內(nèi)/PCR板孔內(nèi)樣品液的溫度來進(jìn)行控制。一般說來，試管溫控更為準(zhǔn)確，因?yàn)楣軆?nèi)樣品的溫度無法與溫控模塊同時達(dá)到預(yù)設(shè)溫度。特別是PCR反應(yīng)中的孵育過程一般都很短暫(30秒或更短)，如果采用只有模塊溫控模式的話，反應(yīng)混合物孵育的時間與程序設(shè)定的時間會有相當(dāng)大的差距。而反應(yīng)管控制精確的算法能自動補(bǔ)償時間，而且適合各種類型的反應(yīng)管，確保反應(yīng)混俁物按照程序設(shè)定的時間維持預(yù)設(shè)溫度。
有的PCR儀廠家推出了另一種溫控方式;熱敏電極溫控模式。該方法將一個熱敏電極插入一個專門的測量管中(管中裝有礦物油)，反應(yīng)進(jìn)行時，將該測量管插入溫控模塊的樣品進(jìn)行檢測。他們認(rèn)為通過此途徑可以監(jiān)測反應(yīng)管內(nèi)樣品的實(shí)際溫度，但這種方法未免有些華而不實(shí);(1)測量管中礦物油的溫度變化與實(shí)際反應(yīng)樣品的溫度變化未必一致;(2)因?yàn)闇y量管必須占用一個樣品孔，所以使用該溫控方式時就無法使用96孔PCR板作實(shí)驗(yàn)。
梯度PCR
對于一個PCR反應(yīng)，雖然有各種各樣的PCR引物設(shè)計軟件或者經(jīng)驗(yàn)公式計算最適的退火溫度，可是由于模版中堿基的組合千變?nèi)f化，對于特殊片斷，經(jīng)驗(yàn)公式得到的數(shù)據(jù)不一定能"P"出來結(jié)果，細(xì)微的變化對結(jié)果都可能產(chǎn)生決定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問題——在反應(yīng)過程中每個孔的溫度控制條件可以在指定范圍內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出最適合的反應(yīng)條件。不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化——對于多種聚合酶混合酶擴(kuò)增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數(shù)高保真Taq酶來說這個非常重要，因?yàn)門aq和校正酶的最佳反應(yīng)溫度可能有顯著差異，優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。多次實(shí)驗(yàn)可在一臺儀器上完成，既節(jié)省實(shí)驗(yàn)時間提高效率，又節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。
對于帶梯度功能的PCR儀，需要考慮梯度模式下不同梯度管排間的溫度均勻性和準(zhǔn)確性，還必須考慮儀器在梯度模式和標(biāo)準(zhǔn)模式下是否具有同樣的溫度特性。這種差異可能導(dǎo)致在梯度模式下得出的最佳條件與標(biāo)準(zhǔn)模式下單獨(dú)做的結(jié)果出現(xiàn)差異。SteadySlope技術(shù)是eppendorf擁有的梯度PCR技術(shù)專利，可以同樣的溫度變化速率到達(dá)所有設(shè)定的梯度溫度，所以在梯度模式下具有恒定的溫度性。這一技術(shù)保證了在梯度模式和普通模式之間可以進(jìn)行可靠的信息傳遞，不會因?yàn)闇囟忍匦圆煌鴮?dǎo)致產(chǎn)量和特異性的變化。MJ公司沒有付專利費(fèi)而選擇在梯度模式下采用不同的降溫速率，每個梯度溫度之間的溫度曲線不同，從梯度模式向普通模式進(jìn)行轉(zhuǎn)換的可能會出現(xiàn)問題。此外采用TCT(三組回路)技術(shù)的梯度PCR儀由于在梯度PCR模式下增加了一個加熱和冷卻的控制區(qū)域，保證了梯度溫度控制的精確性并使不同梯度管排間的溫度均勻性更好。
在PCR儀上增加原位PCR模塊就可以在玻片上進(jìn)行原位PCR擴(kuò)增，MJ和eppendorf的PCR儀都有提供原位適配器以滿足不同需要。購買配有支持原位PCR模塊的PCR儀對從事醫(yī)學(xué)研究的工作者是很值得的，一機(jī)兩用。
此外，隨著基因組高通量研究的需求的提高，各品牌都推出了多槽式高通量PCR儀，各有特長：MJ有一種一拖四，就是1個主機(jī)帶4個擴(kuò)增槽，每個槽可以獨(dú)立控溫，一次可以作96x4個樣品的PCR，不過一旦出現(xiàn)問題4個都不能用了。ABI則在原來的9700的基礎(chǔ)上推出了雙384孔的基座，一次完成384x2個樣品，使得9700的功能又?jǐn)U展到高通量領(lǐng)域而無需購買新的機(jī)器，可惜兩個384槽不能獨(dú)立控溫。eppendorf則有一個控制面板，可以控制5個獨(dú)立的PCR儀，每臺機(jī)器可以聯(lián)合，而且互不影響，但是比較浪費(fèi)空間。
二、儀器的功能性和人性化設(shè)計
當(dāng)然是越簡單方便的設(shè)計最符合用戶的要求。
熱蓋——現(xiàn)在的PCR儀一般均配備熱蓋，熱蓋溫度設(shè)為105℃，使樣品管頂部的溫度達(dá)到105℃左右，蒸發(fā)的反應(yīng)液就不會產(chǎn)生凝集在管蓋上而改變反應(yīng)體積，這樣用戶就無需再向反應(yīng)管內(nèi)加石蠟油，直接減少后繼反應(yīng)的麻煩。如果是旋轉(zhuǎn)加壓的熱蓋就要特別小心，因?yàn)閴毫Φ竭_(dá)時沒有明顯的提示，用戶需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)將熱蓋旋到合適位置，不太容易掌握。如果過松，熱蓋沒有充分接觸反應(yīng)管而影響結(jié)果;如果過緊，則會導(dǎo)致反應(yīng)管變形，甚至可能造成熱蓋的機(jī)械故障。最新的ESP技術(shù)是指熱蓋加熱時不接觸樣品管，避免加熱樣品管導(dǎo)致非特異產(chǎn)物，等加熱到設(shè)定溫度后熱蓋下降，將樣品管壓入加熱模塊，下降時間和壓力都由電子控制。
樣品基座——PCR反應(yīng)多在0.2或者0.5的管子中進(jìn)行，多數(shù)PCR儀也配備了不同的可更換樣品槽適配不同的樣品管。eppendorf有一個有趣的設(shè)計，一個槽內(nèi)帶有0.2和0.5兩種不同樣品孔，不需更換基座就可以分別使用兩種不同的反應(yīng)管，或者96孔板，加原位適配器就可以變成原位PCR了。避免了換基座的麻煩。當(dāng)然不同的反應(yīng)管不可以同時使用的，因?yàn)楦叨炔煌?，熱蓋不能作用。ABI的9700就可以更換不同的樣品槽，樣品槽系列擴(kuò)增到從0.5到標(biāo)準(zhǔn)96孔，到雙384孔板，分別適合不同的需要，相當(dāng)靈活。
軟件——新的PCR儀都比較注重程序編寫的簡易性。大屏幕，顯示實(shí)時信息，倒計時，記憶存儲多個程序、自動斷電保護(hù)等都有助于實(shí)驗(yàn)室中的復(fù)雜環(huán)境使用。程序儲存方面，有人覺得儲存程序的多少似乎意義不太大，但是對于實(shí)驗(yàn)人員多、PCR儀每天運(yùn)作頻繁的實(shí)驗(yàn)室來說，每個使用者獨(dú)立儲存自定義的PCR程序，確實(shí)能方便下一次的調(diào)用，會節(jié)約一些時間。
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